Polymerase Chain Reaction

革命的なDNA増殖技術 ・ DNA鑑定

 


 
特定のDNA文字列を探して増殖

 

ヒトのゲノムは30億個の文字から成り立っている。

遺伝子研究では、この中から特定の文字列を探し出さねばならない(ソーティング)

しかし、探し出すだけでは不十分なのである。その部分のコピーを増やさねばならないのだ。

PCR
とは、DNAの二重ラセンがセンス鎖とアンチセンス鎖でできていることを巧みに利用して、ソーティングとコピーを同時に実現するテクノロジーなのである。

 

その鍵は、2つのプライマーにある。プライマーとは、ごく短い、10から20文字の1本鎖DNAである。

この程度の文字列なら、任意の配列を簡単に人工合成することができる。

今、30億文字からなるゲノムの中のどこかに存在する、1000文字からなる特定の遺伝子を取り出し、増幅したいとしよう。

もとになるゲノムは、犯行現場から採取された犯人のものと思われる髪の毛から抽出されたサンプルで、ほんのわずかな量しかない。しかし失敗は許されない。

1000
文字の配列には、個人を特定できる「指紋」配列が含まれており、これを解読すれば犯人への有力な手がかりが得られるからである。

私たちはまず、1000文字のDNA配列の左端に着目する。

正確にいえば、左端のさらに外側の部分である。

ここは個人差のない、ヒト共通の配列であり、ゲノム・プロジェクトによってすでに文字列は明らかになっている。

プライマー1は、10文字からなり、ちょうどこの端の部分の、アンチセンス鎖に相補的に対合する配列を持つように合成された。

100
℃に加熱されてセンス鎖とアンチセンス鎖に分離したゲノムDNAのサンプルには、プライマー1が添加してある。

 

プライマー1はゲノムに比べて、圧倒的に大景に入れられている。

温度が一旦、50℃まで下げられると、大量のプライマー1は一斉にゲノムの森の中に散らばり、自分とマッチングする相補的な配列を探す。

もし、対合が成立すれば、プライマー1は、そこに落ち着く。

 

長い1本鎖DNAに、短いプライマーがちょこんと結合した場所。

 

ポリメラーゼは、このような場所をきっかけにして初めてDNAの合成反応を開始できる。

つまり、プライマーはその名のとおり、ポリメラーゼ反応を引き起こすための土台として働き、ポリメラーゼは、プライマーへ新たな文字をつなげていく。

 

文序はプライマーが対合するアンチセンス鎖の文字を鋳型として決定されていく。

 

ゲノムの森は深く、類似する配列はおそらく各所に複数あるだろうから、プライマー1はいろいろな場所に結合しうるはずである。

 

対合が完全にマッチしないところにも不完全ながら結合するかもしれない。だからポリメラーゼによる合成は複数の場所で起こる。

 

しかし、重要なことは、プライマー1は、アンチセンス鎖上の、1000文字部分の左端に必ずや対合するだろうということだ。

 

実は、私たちは、もう一つ、プライマー2、と呼ばれるものを用意している。

これは1000文字配列を挟んで、プライマー1が結合した部分のちょうど反対側の端の配列に対合するような10文字からなっている。

 

ここで重要となるのは、プライマー2は、先ほどとは逆に、センス鎖に対合するように配列が設計されているということだ。

 

センス鎖のこの部分に結合したプライマー2は、ここでも、ポリメラーゼ反応のきっかけを作り、新しいDNA鎖の合成を引き起こす。

 

ただし、このプライマーはセンス鎖に対合しているから、合成の方向は、アンチセンス鎖と対合している先ほどのプライマー1とは逆方向となる。

つまり、プライマー1から開始される合成反応と、プライマー2から開始される合成反応とは、1000文字の配列を互いに挟み込むように向かい合いながらも、それぞれ別の鎖を合成するように仕組まれている。

 

その結果、出来上がるのは1000文字配列を含む新しい二本鎖DNAなのである。

しかも、このサイクルは理論上、無限に繰り返しうる。

その都度、1000文字配列は倍増する。たとえ、プライマー12がゲノムの他の場所で働いたとしても、それは別々に起こる些細なノイズでしかない。

 

プライマー1とプライマー2が協調して働く場所は、この1000文字配列を挟んだ部分でしかありえないから、この場所だけが連鎖反応的に増幅される。

その結果、髪の毛一本から出発した極微量のゲノムDNAサンプルから、数時間の後には、PCRマシンの小さな反応チューブの内部で、特定の1000文字配列が10億倍以上に増大されることになる。

まったく見事というほかはないアイデアである。

出所:生物と無生物のあいだ 福岡伸一 2018-03-0150刷 講談社現代新書



 


 

Polymerase chain reaction (PCR)

A technique used to amplify, or make many copies of, a specific target region of DNA.

Key points:

  • Polymerase chain reaction, or PCR, is a technique to make many copies of a specific DNA region in vitro (in a test tube rather than an organism).
  • PCR relies on a thermostable DNA polymerase, Taq polymerase, and requires DNA primers designed specifically for the DNA region of interest.
  • In PCR, the reaction is repeatedly cycled through a series of temperature changes, which allow many copies of the target region to be produced.
  • PCR has many research and practical applications. It is routinely used in DNA cloning, medical diagnostics, and forensic analysis of DNA.

What is PCR?

Polymerase chain reaction
(PCR) is a common laboratory technique used to make many copies (millions or billions!) of a particular region of DNA.

This DNA region can be anything the experimenter is interested in.

For example, it might be a gene whose function a researcher wants to understand, or a genetic marker used by forensic scientists to match crime scene DNA with suspects.

Typically, the goal of PCR is to make enough of the target DNA region that it can be analyzed or used in some other way.

For instance, DNA amplified by PCR may be sent for sequencing, visualized by gel electrophoresis, or cloned into a plasmid for further experiments.

PCR is used in many areas of biology and medicine, including molecular biology research, medical diagnostics, and even some branches of ecology.

Taq polymerase


Like DNA replication in an organism, PCR requires a DNA polymerase enzyme that makes new strands of DNA, using existing strands as templates.

The DNA polymerase typically used in PCR is called Taq polymerase, after the heat-tolerant bacterium from which it was isolated (Thermus aquaticus).

T. aquaticus
lives in hot springs and hydrothermal vents.

Its DNA polymerase is very heat-stable and is most active around 70°C (a temperature at which a human or E. coli DNA polymerase would be nonfunctional).

This heat-stability makes Taq polymerase ideal for PCR. As we'll see, high temperature is used repeatedly in PCR to denature the template DNA, or separate its strands.

PCR primers


Like other DNA polymerases, Taq polymerase can only make DNA if it's given a primer, a short sequence of nucleotides that provides a starting point for DNA synthesis.

In a PCR reaction, the experimenter determines the region of DNA that will be copied, or amplified, by the primers she or he chooses.

PCR primers are short pieces of single-stranded DNA, usually around 20 nucleotides in length. Two primers are used in each PCR reaction, and they are designed so that they flank the target region (region that should be copied).

That is, they are given sequences that will make them bind to opposite strands of the template DNA, just at the edges of the region to be copied. The primers bind to the template by complementary base pairing.

Template DNA:
5' TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT 3' 3' ATAGTCTAGGTACCTCA...CTCATGATCAGGATACTCA 5'
Primer 1: 5' CAGATCCATGG 3' Primer 2:
When the primers are bound to the template, they can be extended by the polymerase, and the region that lies between them will get copied.

Both primers, when bound, point “inward” – that is, in the 5’ to 3’ direction towards the region to be copied. Like other DNA polymerases, Taq polymerase can only synthesize DNA in the 5’ to 3’ direction. When the primers are extended, the region that lies between them will thus be copied.

Attribution: Khan Academy  https://www.khanacademy.org/



 


The steps of PCR

The key ingredients of a PCR reaction are Taq polymerase, primers, template DNA, and nucleotides (DNA building blocks).

The ingredients are assembled in a tube, along with cofactors needed by the enzyme, and are put through repeated cycles of heating and cooling that allow DNA to be synthesized.

The basic steps are:

  1. Denaturation (96°C): Heat the reaction strongly to separate, or denature, the DNA strands. This provides single-stranded template for the next step.

  2. Annealing (55 - 65°C): Cool the reaction so the primers can bind to their complementary sequences on the single-stranded template DNA.

  3. Extension (72°C): Raise the reaction temperatures so Taq polymerase extends the primers, synthesizing new strands of DNA.

This cycle repeats 25 - 35 times in a typical PCR reaction, which generally takes 2 - 4 hours, depending on the length of the DNA region being copied. If the reaction is efficient (works well), the target region can go from just one or a few copies to billions.

That’s because it’s not just the original DNA that’s used as a template each time.

Instead, the new DNA that’s made in one round can serve as a template in the next round of DNA synthesis.

There are many copies of the primers and many molecules of Taq polymerase floating around in the reaction, so the number of DNA molecules can roughly double in each round of cycling.

Attribution: Khan Academy  https://www.khanacademy.org/



 


http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-g...


http://www.onlinebiologynotes.com/polymerase-chain


http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.

 



 


http://www17.a8.net/0.gif?a8mat=1NWF57+6ZUDO2+249K+BWGDThttp://www12.a8.net/0.gif?a8mat=1NWF57+6ZUDO2+249K+BWGDT

原理からよくわかるリアルタイムPCR実験ガイド―基本からより効率的な解析まで必要な機器・試薬と実験 (実験医学別冊 22)

 

もっと知りたい!PCR実験 (KS生命科学専門書)

 

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